ปฏิกิริยาปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอร์ (PCR) ทำงานอย่างไร

สิ่งที่ PCR ต้องทำอย่างไรกับ DNA Sequencing และ Amplifying Genes

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ ( PCR ) เป็นเทคนิคทางพันธุกรรมระดับโมเลกุลสำหรับทำสำเนาหลายยีนและเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการจัดลำดับยีนด้วย

ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์จะทำงานได้อย่างไร?

สำเนายีนจะทำโดยใช้ตัวอย่างของดีเอ็นเอและเทคโนโลยีดีพอที่จะทำสำเนาหลายชุดจากสำเนาเดียวของยีนที่พบในตัวอย่าง การขยายตัวยีนของ PCR เพื่อสร้างสำเนานับล้านชุดช่วยในการตรวจจับและระบุลำดับยีนโดยใช้เทคนิคภาพตามขนาดและค่าใช้จ่าย (+ หรือ -) ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ

ภายใต้เงื่อนไขที่ควบคุม DNA ส่วนเล็ก ๆ จะถูกสร้างขึ้นโดยเอนไซม์ที่เรียกว่าดีเอ็นเอโพลิเมอร์ที่เพิ่ม deoxynucleotides (dNTPs) ไปยังชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่เรียกว่า "แม่แบบ" แม้แต่ชิ้นส่วนเล็ก ๆ ของดีเอ็นเอที่เรียกว่าไพรเมอร์ถูกใช้เป็นจุดเริ่มต้นของพอลิเมอร์ Primers เป็นชิ้น DNA ที่มนุษย์สร้างขึ้น (oligomers) ขนาดเล็กโดยปกติจะมีความยาวระหว่าง 15 ถึง 30 nucleotides พวกเขาจะทำโดยรู้หรือเดาลำดับดีเอ็นเอสั้นที่ปลายมากของยีนที่ถูกขยาย ระหว่าง PCR DNA ถูกเรียงลำดับจะถูกให้ความร้อนและเส้นคู่จะแยกออกจากกัน เมื่อเย็นลงไพรเมอร์จะผูกมัดกับเทมเพลต (เรียกว่าการหลอม) และสร้างสถานที่สำหรับโพลิเมอร์ที่จะเริ่มต้น

เทคนิค PCR

ปฏิกิริยาของเอนไซม์ polymerase chain reaction (PCR) เกิดขึ้นได้จากการค้นพบ thermophiles และ thermophilic polymerase เอนไซม์ (เอนไซม์ที่รักษาความสมบูรณ์ของโครงสร้างและการทำงานหลังจากความร้อนที่อุณหภูมิสูง)

ขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับเทคนิค PCR มีดังนี้:

• มีการสร้างส่วนผสมด้วยความเข้มข้นของดีเอ็นเอแม่เอนไซม์โพลีเมอร์ไพรเมอร์และ dNTPs ความสามารถในการให้ความร้อนผสมโดยไม่ทำให้กลายเป็นเอนไซม์ช่วยในการทำซ้ำของตัวอย่างเกลียวคู่ของตัวอย่างดีเอ็นเอที่อุณหภูมิอยู่ในช่วง 94 องศาเซลเซียส

• หลังจาก denaturation ตัวอย่างจะถูกระบายความร้อนให้อยู่ในช่วงปานกลางมากขึ้นประมาณ 54 องศาซึ่งจะช่วยในการย้อมสี (primer) ของ primers กับแบบดีเอ็นเอแบบ single-stranded
• ในขั้นตอนที่สามของวัฏจักรตัวอย่างจะถูกให้ความร้อนถึง 72 องศาอุณหภูมิที่เหมาะสำหรับ Taq DNA Polymerase สำหรับการยืดตัว ในระหว่างการยืดตัวดีเอ็นเอโพลิเมอร์จะใช้ดีเอ็นเอเดี่ยวชิ้นเดียวเป็นเทมเพลตเพื่อเพิ่ม dNTP ที่เสริมเข้าไปในปลายทั้ง 3 ของแต่ละ primer และสร้างส่วนของดีเอ็นเอแบบคู่ในบริเวณของยีนที่น่าสนใจ
• ไพรเมอร์ที่อ่อนตัวลงกับลำดับดีเอ็นเอที่ไม่ตรงตามที่กำหนดไว้จะไม่คงตัวที่ 72 องศาซึ่งจะ จำกัด การยืดตัวของยีนที่น่าสนใจ

กระบวนการนี้ทำให้เกิดการเสื่อมสภาพการหลอมและการยืดตัวซ้ำหลายครั้ง (30-40 ครั้ง) ซึ่งจะเป็นการเพิ่มจำนวนสำเนาของยีนที่ต้องการในส่วนผสม แม้ว่ากระบวนการนี้จะน่าเบื่อถ้าทำด้วยตัวเองตัวอย่างสามารถจัดเตรียมและบ่มในเครื่อง Thermocycler ที่สามารถตั้งโปรแกรมได้ซึ่งปัจจุบันเป็นที่รู้จักกันทั่วไปในห้องปฏิบัติการโมเลกุลส่วนใหญ่และสามารถทำปฏิกิริยา PCR ได้อย่างสมบูรณ์ภายใน 3-4 ชั่วโมง

แต่ละขั้นตอน denaturing จะหยุดกระบวนการยืดตัวของวงจรก่อนหน้านี้ซึ่งจะตัดทอนเส้นใย DNA ใหม่ ๆ และทำให้ขนาดของยีนดังกล่าวมีขนาดประมาณ

ระยะเวลาของรอบการยืดตัวสามารถทำได้นานหรือสั้นขึ้นอยู่กับขนาดของยีนที่น่าสนใจ แต่ในที่สุดก็ผ่านรอบซ้ำของ PCR ส่วนใหญ่แม่แบบจะถูก จำกัด ให้มีขนาดของยีนที่น่าสนใจเพียงอย่างเดียวตามที่พวกเขา จะได้รับการสร้างขึ้นจากผลิตภัณฑ์ของทั้งสองไพรเมอร์

มีหลาย ปัจจัยที่ แตกต่างกัน สำหรับ PCR ที่ประสบความสำเร็จ ซึ่งสามารถจัดการเพื่อเพิ่มผลลัพธ์ได้ วิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายในการทดสอบการปรากฏตัวของผลิตภัณฑ์ PCR คือการทำ อิเล็กโตรโฟเรสซิสแบบ agarose gel ซึ่งใช้ในการแยกชิ้นส่วน DNA ตามขนาดและค่าใช้จ่าย ชิ้นส่วนจะถูกมองเห็นโดยใช้สีย้อมหรือไอโซโทปรังสี

วิวัฒนาการ

ตั้งแต่การค้นพบ PCR DNA polymerases อื่นนอกเหนือจาก Taq เดิมได้ถูกค้นพบ บางส่วนมีคุณสมบัติ "proofreading" ที่ดีขึ้นหรือมีเสถียรภาพมากขึ้นที่อุณหภูมิสูงขึ้นซึ่งจะช่วยปรับปรุงความเฉพาะเจาะจงของ PCR และลดข้อผิดพลาดจากการแทรก dNTP ที่ไม่ถูกต้อง

PCR บางรูปแบบได้รับการออกแบบสำหรับการใช้งานที่เฉพาะเจาะจงและปัจจุบันใช้เป็นประจำในห้องปฏิบัติการทางพันธุกรรมโมเลกุล บางส่วนเป็น Real-Time PCR และ Reverse-Transcriptase PCR การค้นพบ PCR ยังนำไปสู่การพัฒนาลำดับเบส ดีเอ็นเอ และเทคนิคโมเลกุลอื่น ๆ