การปรับส่วนประกอบใด ๆ ของปฏิกิริยาปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอเรส (PCR) สามารถเปลี่ยนแปลงคุณภาพของผลลัพธ์ได้โดยการปรับปรุงหรือลดผลผลิตและคุณภาพของผลิตภัณฑ์หรือโดยการปรับปรุงความจำเพาะและปฏิกิริยาเฉพาะของปฏิกิริยา พารามิเตอร์ที่มีอิทธิพลต่อผลลัพธ์สุดท้ายอาจเป็นได้ทั้งทางกายภาพ (เช่นอุณหภูมิรอบเวลา) หรือสารเคมี (เช่นความเข้มข้นของแม่แบบชนิดของเอนไซม์ที่ใช้) ต่อไปนี้เป็นปัจจัยสำคัญหลายประการที่มีอิทธิพลต่อความสำเร็จของ PCR
01 สภาพห้องปฏิบัติการสะอาด
เนื่องจาก พีซีอาร์ สามารถตรวจจับโมเลกุลเดี่ยวของดีเอ็นเอได้จึงเป็นเรื่องสำคัญที่ต้องรักษาสภาพเก่าแก่ในห้องปฏิบัติการ สวมถุงมือใหม่เสมอควรใช้เครื่องแก้วที่ปราศจากเชื้อท่อและปลายท่อและวิธีการฆ่าเชื้อและทำความสะอาดพื้นที่ทำงานก่อนเริ่มทำงาน
ควรมีปฏิกิริยาควบคุมโดยไม่มีเทมเพลตดีเอ็นเอและไม่มีเอนไซม์เพื่อให้มั่นใจได้ว่าผลลัพธ์จะเกิดขึ้นจากการขยายตัวอย่างที่ถูกต้อง
คนส่วนใหญ่ตรวจสอบให้แน่ใจว่ามีชุดโซลูชันของตัวเองที่ไม่ได้ใช้ร่วมกันเพื่อแก้ไขปัญหาให้ง่ายขึ้นและกำหนดให้ใช้ปิเปตเฉพาะสำหรับ PCR เท่านั้น ท่อพีซีอาร์ DNase และ RNase-free ปราศจากละอองลอยและทำงานในตู้ดูดควันพร้อมแสง UV เป็นวิธีลดปัญหา
02 ส่วนประกอบทางเคมี
- มีฐานตั้งแต่ 18 ถึง 24
- ไม่มีโครงสร้างรอง (เช่นลูปปิ่น)
- มีการแจกจ่ายสมดุลของคู่ G / C และ A / T
- จะไม่เสริมกันที่ปลาย 3 ฟุต
- อุณหภูมิหลอมละลาย (Tm) ประมาณ 5-10 องศาเซลเซียสต่ำกว่าอุณหภูมิการอบแห้งซึ่งโดยปกติจะอยู่ระหว่าง 55 ถึง 65 องศาเซลเซียส
Tm สำหรับไพรเมอร์ควรมีความคล้ายคลึงกันเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด
03 Reaction Mix: เทมเพลตและไพรเมอร์
ความเข้มข้นของไพรเมอร์ที่เหมาะสมอยู่ระหว่าง 0.1 ถึง 0.6 micromoles / L ปริมาณของแม่แบบแตกต่างกันไปขึ้นอยู่กับชนิดของดีเอ็นเอ (มนุษย์แบคทีเรีย plasmid)
ด้วยเทมเพลตที่มีจำนวนน้อยมากมีกลยุทธ์อื่น ๆ ในการปรับปรุงผลลัพธ์เช่นจำนวนรอบที่เพิ่มขึ้นหรือการใช้ "จุดเริ่มต้นร้อน" ทดสอบ primers ใหม่เสมอด้วยปฏิกิริยาควบคุมที่เป็นบวกเพื่อให้แน่ใจว่าพวกเขาทำงานภายใต้เงื่อนไขการทดลองเฉพาะของคุณ
04 Reaction Mix: กิจกรรมเอนไซม์
ความเข้มข้นของ MgCl2 ในปฏิกิริยาผสมจะมีผลต่อผล PCR และอาจมีบทบาทสำคัญในการเกิดปฏิกิริยาที่กระด้างขึ้น แมกนีเซียมไอออนบวกสร้างคอมเพรสเซอร์ที่ละลายน้ำได้ด้วย dNTPs เพื่อผลิตสารตั้งต้นที่แท้จริงที่เอนไซม์โพลิเมอร์จำแนกได้
จำนวนเท่ากับของทั้งสี่ dNTPs ยังช่วยลดอัตราความผิดพลาดของโพลิเมอร์ สารเติมแต่งบางอย่างเช่น betaine, BSA, ผงซักฟอก, DMSO, กลีเซอรอลและ pyrophosphatase ยังสามารถส่งผลต่อประสิทธิภาพของเอนไซม์หรือปฏิกิริยาได้ด้วย
05 ประเภทของเครื่องทำ Thermocycler
เมื่อซื้ออุปกรณ์ห้องปฏิบัติการโปรดระลึกไว้ว่า thermocyclers บางตัวมีความแม่นยำน้อยกว่าคนอื่น ๆ ในการรักษาอุณหภูมิที่แน่นอนและที่ต้องการ
นี้เป็นพื้นที่ที่จะถูกจะไม่จ่ายออกในระยะยาวเมื่อคุณต้องเผชิญกับปฏิกิริยาจู้จี้จุกจิกหรือใช้ไพรเมอร์ที่ต้องใช้ช่วงอุณหภูมิที่แคบของการอบ
ท่อปฏิกิริยาที่มีเส้นผ่าศูนย์กลางบาง ๆ ที่ออกแบบมาให้พอดีกับตัวทำละลายเทอร์โมไซเซอร์ที่แม่นยำที่คุณกำลังใช้ยังช่วยเพิ่มอุณหภูมิในการทำปฏิกิริยา
06 การตั้งค่า Cycle
ผลผลิตที่เพิ่มขึ้นสามารถทำได้โดยการเพิ่มระยะเวลาการต่อขยายทุกๆ 20 รอบเพื่อชดเชยเอนไซม์น้อยลงเพื่อขยายแม่แบบมากขึ้น โดยปกติแล้วน้อยกว่า 40 รอบจะเพียงพอที่จะขยายโมเลกุลของเทอร์โบน้อยกว่า 10 เทมเปิลให้มีความเข้มข้นมากพอที่จะสามารถมองเห็นได้บน เจล agarose gel ซึ่งเป็น ethidium bromide