ลำดับดีเอ็นเอยังขึ้นอยู่กับความสามารถของเราในการใช้ เจลอิเลคโตรโฟเรซิส ในการแยกดีเอ็นเอของเส้นใยที่มีขนาดแตกต่างกันโดยมีขนาดเพียงคู่เดียว
ลำดับดีเอ็นเอ
ในช่วงปลายทศวรรษที่ 1970 มีการคิดค้นเทคนิคดีเอ็นเอลำดับดีเอ็นเอสำหรับ DNA โมเลกุลอีกต่อไป เหล่านี้เป็นวิธี แซนเจอร์ (หรือ didexy) และวิธี Maxam-Gilbert (chemical cleavage) วิธีการของ Maxam-Gilbert อิงตามความแตกแยกเฉพาะของ nucleotide โดยใช้สารเคมีและใช้ดีที่สุดในการเรียงลำดับ oligonucleotides (สั้น nucleotide polymers มักมีขนาดเล็กกว่า 50 คู่เบส) วิธีการแซงเจอร์ใช้กันมากเพราะได้รับการพิสูจน์แล้วว่าใช้เทคนิคได้ง่ายขึ้นและด้วยการ มาถึงของ PCR และระบบอัตโนมัติของเทคนิคนั้นสามารถนำไปประยุกต์ใช้กับดีเอ็นเอสายยาวรวมทั้งยีนทั้งหมดได้ด้วย เทคนิคนี้จะขึ้นอยู่กับการสิ้นสุดของโซ่ด้วย dideoxynucleotides ในระหว่างการยืดตัวของ PCR
วิธีแซนเจอร์
ในวิธีแซนเจอร์การวิเคราะห์เส้นใยดีเอ็นเอจะใช้เป็นแม่แบบและใช้ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ในปฏิกิริยา PCR เพื่อสร้างเส้นใยฟรีโดยใช้ไพรเมอร์
เตรียมสารผสมปฏิกิริยา PCR ที่แตกต่างกัน 4 ชนิดซึ่งแต่ละส่วนมีเปอร์เซ็นต์ของสารสังเคราะห์ didexynucleoside triphosphate (ddNTP) ถึงหนึ่งในสี่ nucleotides (ATP, CTP, GTP หรือ TTP) การสังเคราะห์ดีเอ็นเอใหม่จะยังคงดำเนินอยู่ต่อไปจนกว่าจะมีการรวมตัวของอะนาล็อกเหล่านี้ลงไปในเวลานั้นเส้นจะถูกตัดก่อนกำหนด
ปฏิกิริยาของ PCR แต่ละตัวจะมีส่วนผสมของเส้นใยดีเอ็นเอที่แตกต่างกันซึ่งทั้งหมดจะลงท้ายด้วย nucleotide ที่ติดฉลาก dideoxy สำหรับปฏิกิริยาดังกล่าว เจล อิเล็กโตรโฟเรซิส ใช้แยกเส้นใยของปฏิกิริยาทั้งสี่ออกเป็นสี่เลนและกำหนดลำดับของแม่แบบเดิมตามความยาวของเส้นใยที่สิ้นสุดด้วยสิ่งที่เป็นนิวคลีโอไทด์
ในปฏิกิริยาแซงเจอร์อัตโนมัติจะมีการใช้ไพรเมอร์ที่มีป้ายเรืองแสงหลากสีสี่สี ปฏิกิริยา PCR ในกรณีที่มี nucleotide didexy ต่างกันจะทำตามที่อธิบายข้างต้น อย่างไรก็ตามต่อจากนั้นสารผสมทั้ง 4 ชนิดจะรวมกันและใช้กับเลนเดียวของเจล สีของแต่ละส่วนถูกตรวจจับโดยใช้ลำแสงเลเซอร์และข้อมูลจะถูกเก็บรวบรวมโดยคอมพิวเตอร์ซึ่งจะสร้างโครมาโตแกรมที่แสดงยอดของแต่ละสีซึ่งสามารถกำหนดลำดับดีเอ็นเอเทมเพลตได้
โดยปกติวิธีการเรียงลำดับแบบอัตโนมัติจะใช้ได้เฉพาะกับลำดับขั้นสูงสุดที่มีความยาวประมาณ 700-800 คู่ฐานเท่านั้น อย่างไรก็ตามมันเป็นไปได้ที่จะได้ลำดับยีนที่มีขนาดใหญ่และในความเป็นจริงทั้งจีโนมโดยใช้วิธีการขั้นตอนที่ชาญฉลาดเช่น Primer Walking และ Shotgun sequencing
ใน Primer Walking ส่วนที่สามารถทำงานได้ของยีนขนาดใหญ่จะเรียงตามลำดับโดยใช้วิธี Sanger primers ใหม่จะถูกสร้างขึ้นจากส่วนที่น่าเชื่อถือของลำดับและใช้เพื่อดำเนินการต่อลำดับส่วนของยีนที่อยู่นอกช่วงของปฏิกิริยาเดิม
การเรียงลำดับ Shotgun ทำให้เกิดการสุ่มตัดส่วนของดีเอ็นเอที่น่าสนใจลงในส่วนที่เหมาะสมกว่า (สามารถจัดการได้) การเรียงลำดับแต่ละส่วนและการจัดเรียงชิ้นส่วนตามลำดับซ้อนกัน เทคนิคนี้ทำได้ง่ายขึ้นโดยการประยุกต์ใช้ซอฟต์แวร์คอมพิวเตอร์เพื่อจัดเรียงซ้อนทับกัน