ระดับความบริสุทธิ์ของโปรตีนที่ต้องการขึ้นอยู่กับการใช้โปรตีนที่ต้องการ
สำหรับสารละลายบางชนิดสารสกัดหยาบจะเพียงพอ อย่างไรก็ตามสำหรับการใช้งานอื่น ๆ เช่นในอาหารและยาจำเป็นต้องมีระดับความบริสุทธิ์สูง เพื่อให้บรรลุนี้หลายวิธีการทำให้บริสุทธิ์โปรตีนมักจะใช้ในชุดของขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์
ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนแต่ละครั้งส่งผลให้ระดับการสูญเสียผลิตภัณฑ์ลดลง ดังนั้นกลยุทธ์การทำให้บริสุทธิ์โปรตีนที่เหมาะคือขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ที่สุดในขั้นตอนน้อยที่สุด การเลือกขั้นตอนที่จะใช้ขึ้นอยู่กับขนาดการสะสมความสามารถในการละลายและคุณสมบัติอื่น ๆ ของโปรตีนเป้าหมาย เทคนิคต่อไปนี้เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำให้เป็นโปรตีน cytosolic เดี่ยว การทำให้บริสุทธิ์ของเซลล์โปรตีน cytosolic มีความซับซ้อนมากขึ้นและโดยปกติจะต้องใช้วิธีการที่แตกต่างกัน
ขั้นตอนแรกสำหรับการทำโปรตีน
ขั้นตอนแรกในการทำให้บริสุทธิ์ ภายในเซลล์ (ภายในเซลล์) โปรตีนคือการจัดทำ สารสกัดหยาบ
สารสกัดจะมีส่วนผสมที่ซับซ้อนของโปรตีนทั้งหมดจาก cytoplasm เซลล์และมีโมเลกุลเล็ก ๆ ที่มีร่วมและสารอาหารมากขึ้น สารสกัดหยาบอาจใช้สำหรับการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีชีวภาพบางอย่าง แต่ถ้าความบริสุทธิ์เป็นปัญหาต้องทำตามขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ต่อไป
สารสกัดโปรตีนดิบถูกเตรียมโดยการกำจัดเศษซากเซลล์ที่เกิดจากการแยกเซลล์ซึ่งสามารถทำได้โดยใช้สารเคมีและ เอนไซม์ sonication หรือ French Press เศษจะถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงและ supernatant จะฟื้นตัว การเตรียมโปรตีนของโปรตีนนอกเซลล์สามารถทำได้โดยการถอดเซลล์ออกโดยการปั่นแยก
สำหรับแอพพลิเคชัน ด้านเทคโนโลยีชีวภาพ บางอย่างมีความต้องการเอนไซม์ที่ทนความ ร้อนได้ : เอนไซม์ที่สามารถทนต่ออุณหภูมิสูงโดยไม่ทำให้เกิดการเสื่อมสภาพได้และในขณะที่ยังคงรักษากิจกรรมที่เฉพาะเจาะจงไว้สูง สิ่งมีชีวิตที่ก่อให้เกิดพวกมันมักเรียกว่า extremophiles วิธีที่ง่ายในการทำให้บริสุทธิ์โปรตีนที่ทนต่อความร้อนคือการทำให้โปรตีนอื่น ๆ ที่เป็นส่วนผสมในตัวทำละลายโดยการให้ความร้อนแล้วระบายความร้อนให้กับสารละลาย (ทำให้เอนไซม์สามารถปรับเปลี่ยนหรือ redissolve ถ้าจำเป็นโปรตีนที่ถูกทำให้เสียรูปสามารถถูกแยกออกได้โดยการหมุนเหวี่ยง
ขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ขั้นกลาง
ในอดีตขั้นตอนที่สองร่วมกันในการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์จากสารสกัดหยาบเป็นสาร เร่งรัด ในสารละลายที่มีความเข้มข้นสูง (เช่นสารละลายเกลือ) กรดนิวคลีอิกในสารสกัดหยาบสามารถกำจัดได้โดยการตกตะกอนมวลรวมที่เกิดขึ้นกับ streptomycin sulfate หรือ protamine sulfate
การตกตะกอนของโปรตีนมักทำโดยใช้แอมโมเนียมซัลเฟตเป็นเกลือ
โปรตีนต่าง ๆ จะตกตะกอนใน แอมโมเนียมซัลเฟตที่ แตกต่างกัน โดยทั่วไปโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงขึ้นจะตกตะกอนในแอมโมเนียมซัลเฟตที่ลดลง การตกตะกอนเกลือไม่ได้มักจะนำไปสู่โปรตีนบริสุทธิ์สูง แต่สามารถช่วยในการขจัดโปรตีนที่ไม่พึงประสงค์บางอย่างในส่วนผสมและมุ่งเน้นตัวอย่าง เกลือในสารละลายจะถูกกำจัดออกโดยการฟอกไตผ่านท่อเซลลูโลสที่มีรูพรุน, การกรองหรือเจลยกเว้นโครมาโทกราฟี
โปรโตคอลเทคโนโลยีชีวภาพที่ทันสมัยมักใช้ประโยชน์จากชุดเครื่องมือที่มีจำหน่ายในท้องตลาดจำนวนมากซึ่งพร้อมให้บริการโซลูชั่นสำเร็จรูปสำหรับขั้นตอนมาตรฐาน การฟอกสีของโปรตีนมักใช้โดยใช้ตัวกรองและคอลัมน์การกรองเจลที่เตรียมไว้ สิ่งที่คุณต้องทำคือทำตามคำแนะนำและเพิ่มปริมาณที่ถูกต้องของการแก้ปัญหาที่เหมาะสมและรอระยะเวลาที่กำหนดในขณะที่เก็บ eluant (สิ่งที่ออกมาในส่วนอื่น ๆ ของคอลัมน์) ในหลอดทดสอบสด
- วิธีการโครมาโตกราฟีสามารถใช้โดยใช้คอลัมน์ด้านบนหรืออุปกรณ์ HPLC แบบอัตโนมัติ การแยกด้วย HPLC สามารถทำได้โดยการทำ reverse phase การแลกเปลี่ยนไอออนหรือการยกเว้นขนาดและตัวอย่างที่ตรวจพบโดยอาร์เรย์ไดโอดหรือเทคโนโลยีเลเซอร์
การสร้างโปรตีนและการประเมินภาวะบริสุทธิ์
- Reverse-phase chromatography (RPC) แยกโปรตีนออกจาก hydrophobicities สัมพัทธ์ เทคนิคนี้มีการคัดเลือกสูง แต่ต้องใช้ตัวทำละลายอินทรีย์ โปรตีนบางตัวถูกทำละลายโดยตัวทำละลายอย่างถาวรและจะสูญเสียสมรรถนะระหว่าง RPC ดังนั้นจึงไม่แนะนำให้ใช้วิธีนี้สำหรับการใช้งานทั้งหมดโดยเฉพาะอย่างยิ่งถ้าจำเป็นเพื่อให้โปรตีนเป้าหมายเก็บกิจกรรม
- การแลกเปลี่ยนไอออนโครมาโตกราฟี หมายถึงการแยกโปรตีนตาม ประจุ คอลัมน์สามารถเตรียมการแลกเปลี่ยนไอออนไนซ์หรือแลกเปลี่ยนไอออนได้ คอลัมน์การ แลกเปลี่ยนไอออนไนซ์ มีเฟสคงที่ซึ่งมีประจุบวกที่ดูดซับโปรตีนที่มีประจุไฟฟ้าลบ คอลัมน์ แลกเปลี่ยนไอออนบวกเป็นอนุภาคประจุ ลบที่ประจุลบซึ่งดึงดูดโปรตีนที่มีประจุบวก การกำจัดโปรตีนเป้าหมายโดยการเปลี่ยนค่าความเป็นกรด - ด่างในคอลัมน์ซึ่งจะส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงหรือการวางตัวเป็นกลางของกลุ่มที่มีประจุไฟฟ้าในแต่ละโปรตีน
- การ กรอง ขนาดอนุภาค ( การกรองด้วยเจล ) จะแยกโปรตีนขนาดใหญ่ออกจากโปรตีนขนาดเล็กเนื่องจากโมเลกุลที่มีขนาดใหญ่เดินทางได้เร็วขึ้นผ่านโพลิเมอร์ที่ผ่านการเชื่อมโยงกันในคอลัมน์ chromatography โปรตีนขนาดใหญ่ไม่พอดีกับรูขุมขนของพอลิเมอร์ในขณะที่โปรตีนขนาดเล็กทำและใช้เวลานานกว่าในการเดินทางผ่านคอลัมน์โครมาโตกราฟีผ่านทางตรงที่น้อยกว่า Eluate ถูกเก็บรวบรวมเป็นชุดของหลอดแยกโปรตีนตามเวลาการเจือจาง การกรองด้วยเจลเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการมุ่งเน้นตัวอย่างโปรตีนเนื่องจากโปรตีนเป้าหมายถูกเก็บในปริมาณที่น้อยลงกว่าการเติมลงในคอลัมน์ก่อน เทคนิคการกรองแบบเดียวกันอาจใช้ในระหว่างการผลิตโปรตีนขนาดใหญ่เนื่องจากมีประสิทธิภาพด้านต้นทุน
- Affinity โครมาโตกราฟี เป็นเทคนิคที่มีประโยชน์มากสำหรับการ "ขัดผิว" หรือทำให้กระบวนการทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนสมบูรณ์ ลูกปัดในคอลัมน์โครมาโทกราฟีมีการเชื่อมโยงข้ามกับแกนด์ที่ผูกเฉพาะกับโปรตีนเป้าหมาย โปรตีนจะถูกลบออกจากคอลัมน์ด้วยการล้างด้วยสารละลายที่มีลิแกนด์ฟรี วิธีนี้ทำให้ได้ผลที่บริสุทธิ์และมีความเฉพาะเจาะจงมากที่สุดเมื่อเทียบกับเทคนิคอื่น ๆ
- SDS-PAGE เป็นอิเลคโตรโฟเรซิสจาก polyacrylamide ซึ่งทำในที่ที่มี SDS (sodium dodecyl sulfate) ซึ่งจะเกาะกับโปรตีนทำให้มีประจุลบสุทธิมาก เนื่องจากข้อกล่าวหาของโปรตีนทั้งหมดมีความเท่าเทียมกันวิธีนี้จึงแยกแยะความแตกต่างของขนาดเกือบทั้งหมดขึ้นอยู่กับขนาด SDS-PAGE มักใช้เพื่อทดสอบความบริสุทธิ์ของโปรตีนหลังจากแต่ละขั้นตอนเป็นชุด เมื่อโปรตีนที่ไม่ต้องการออกจากส่วนผสมจะมีจำนวนแถบที่เห็นบนเจล SDS-PAGE ลดลงจนกว่าจะมีเพียงแถบเดียวแทนโปรตีนที่ต้องการ
- Immunoblotting เป็นเทคนิคการสร้างภาพโปรตีนที่ใช้ร่วมกับ chromatography เกี่ยวกับความสัมพันธ์ แอนติบอดีสำหรับโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงใช้เป็นแกนด์ในคอลัมน์โครมาโตกราฟฟีความสัมพันธ์ โปรตีนเป้าหมายเก็บรักษาไว้ในคอลัมน์จากนั้นล้างออกด้วยการล้างคอลัมน์ด้วยสารละลายเกลือหรือสารอื่น ๆ แอนติบอดีที่เชื่อมโยงกับฉลากกัมมันตภาพรังสีหรือย้อมติดจะช่วยในการตรวจหาโปรตีนเป้าหมายเมื่อแยกออกจากส่วนอื่น ๆ ของส่วนผสม
แหล่งที่มา:
Zubay G. 1988 ชีวเคมีฉบับที่ 2 แมคมิลแลนพับลิชชิ่งนิวยอร์กนิวยอร์กสหรัฐอเมริกา
Amersham Pharmacia เทคโนโลยีชีวภาพ 1999. Protein Purification Handbook, AB ฉบับที่ Amersham Pharmacia Biotech Inc. มลรัฐนิวเจอร์ซีย์สหรัฐอเมริกา http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf